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细胞活性定磷比色法定量检测试剂盒实验步骤

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1. 准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞(5 X 106细胞)
2. 小心加入 xx 毫升预冷的 SBJ 清理液(试剂 A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞
5. 加入 xx 毫升 SBJ 清理液(试剂 A),混匀细胞
6. 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟,速度为 300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入 xx 微升S B J   裂解液(试剂 B),充分混匀
10.转移到预冷的 1.5 毫升离心管
11.强力涡旋震荡 15 秒
12.置于冰槽里孵育 30 分钟
13.放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟,速度为 16000g(或 13000RPM)
14.小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1。5 毫升离心管
15.移取 2  微升进行蛋白定量测定
16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、细胞活性定磷比色法定量检测试剂盒测定准备
1. 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取液等),置于冰槽里(注意:样品须澄清)
2. 设定好分光光度仪(温度为 30℃):波长为 660nm,并置零
3. 准备好 5 个 1.5 毫升离心管,标记为 1 至 5 号管
4. 按下表分别加入S B J   阴性液(试剂 D)和 SBJ标准液(试剂 H)到每个离心管, 混匀
5. 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表:
管号    SBJ阴性液(试剂 D)    SBJ 标准液(试剂 H)    测定体系标准磷浓度
1                0                  xx 微升                 20 微摩尔/升
2             xx 微升               xx 微升                 15 微摩尔/升
3             xx 微升               xx 微升                 10 微摩尔/升
4             xx 微升               xx 微升           5 微摩尔/升
5             xx 微升                 0                           0

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